Chiếc nguyên mẫu (K5054) bay lần đầu tiên ngày 5 tháng 5 năm 1936, tại sân bay Southampton (lúc đó còn mang tên là sân bay Eastleigh) chỉ bốn tháng sau chuyến bay đầu tiên của kiểu máy bay hiện đại Hawker Hurricane. Việc thử nghiệm được tiếp tục cho đến ngày 26 tháng 5 năm 1936 khi Đại úy J. "Mutt" Summers, phi công thử nghiệm chính của Vickers (Aviation) Ltd., lái chiếc K5054 đến căn cứ Không quân Hoàng gia RAF Martlesham Heath và bàn giao chiếc máy bay cho đơn vị thử nghiệm của Không quân Hoàng gia Anh.

Bộ Hàng không đặt hàng 310 chiếc vào ngày 3 tháng 6 năm 1936, ngay trước khi có các báo cáo thử nghiệm, và các báo cáo thử nghiệm cũng chỉ tiến hành theo cách nhỏ giọt. Công chúng Anh Quốc được thấy chiếc Spitfire lần đầu tiên tại buổi trưng bày hàng không tại sân bay Không quân Hoàng gia Hendon vào ngày thứ bảy 27 tháng 6 năm 1936.

Để chế tạo Spitfire với số lượng được đặt trước, một xưởng hoàn toàn mới được xây dựng tại Castle Bromwich, gần Birmingham, là một "bản sao" của xưởng ban đầu của hãng Supermarine tại Southampton. Mặc dù kế hoạch được sự lãnh đạo tuyệt đối bởi Lord Nuffield vốn là một chuyên gia về xây dựng quy mô trong công nghiệp động cơ và ô-tô, công việc xây dựng căng thẳng đòi hỏi tay nghề và kỹ thuật vượt ngoài kinh nghiệm của lực lượng lao động tại chỗ, nên đã cần đến nhân viên kinh nghiệm và kỹ sư của Supermarines và Vickers-Armstrongs. Vị trí được xây dựng nhanh chóng từ tháng 7 năm 1938, máy móc được lắp đặt hai tháng sau khi công việc được khởi đầu.

Đã có hơn 20.300 chiếc thuộc mọi phiên bản được chế tạo, bao gồm phiên bản hai chỗ ngồi dùng trong huấn luyện, một số chiếc Spitfire phục vụ cho đến tận những năm 1950. Mặc dù đối thủ chủ yếu thời chiến tranh, chiếc Messerschmitt Bf 109, trong nhiều phiên bản khác nhau, vượt hơn Spitfire về số lượng được sản xuất, Spitfire là kiểu máy bay tiêm kích Anh Quốc duy nhất được sản xuất liên tục trước, trong, và sau Thế Chiến II.